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在酸性环境中，过氧化氢可将Fe2+离子氧化成Fe3+离子，Fe3+离子再与染料分子结合形成Fe3+-染料复合物，该复合物在560nm或595nm处有最大吸收波长，且吸光值与过氧化氢的浓度成正比。本试剂盒针对溶解于脂相中的样品而设计，通过添加特殊的增敏剂，增强了过氧化氢的检测信号，使得过氧化氢的检测灵敏度得到很大提高，可应用于监测低密度脂蛋白和脂蛋白中脂类的氧化情况及细胞活性，血清或血浆中的过氧化氢含量和在有脂类物质存在的情况下，不要对生物样品抽提，直接定量分析过氧化氢含量。本试剂盒定量过氧化氢的浓度范围为1～250μM，可使用离心管法50次或酶标法250次。

• 不需要过氧化氢酶，灵敏快速，即用型产品；
  
• 不需要进行脂肪提取，利用光谱分析无需加热；
  
• 用于监测低密度脂蛋白和脂蛋白中脂类的氧化情况和细胞活性，血清或血浆中的过氧化氢含量和在有脂类物质存在时，直接分析过氧化氢含量。

• 工作液须现配现用，不能够长期保存，过夜后须废弃，并且吸光值检测最好当天完成。
  
• 样品稀释的倍数应使其过氧化氢含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释。
  
• 若样品中的过氧化氢含量>250μM且不适合稀释，可适当提高工作液与待测样品的比例，如工作液∶样品=100∶1或50∶1，同时提高标准品在制作标准曲线时的过氧化氢浓度。
  
• 过量的过氧化氢(>1mM)对染料分子具有漂白作用，会导致吸光值急剧下降。
  
• 若样品中含有过渡金属、金属螯合剂、金属蛋白及其它在检测波长处有强吸光值的物质，须使用溶液B和样品的混合液(即10份溶液B和1份样品，不含溶液A)作为检测样品时的背景对照。
  
• 若需要精确的定量过氧化氢浓度，建议在初步测定样品中过氧化氢浓度后，缩小标准曲线的浓度范围和梯度，以提高标准曲线的精度。
  
• 溶液A具有腐蚀性，请在使用前做好防护。
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕。
  
• 使用后请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气中的物质发生化学反应。
  
• 本试剂盒只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果，概不承担责任。

• 试剂准备
  
  • 按照以下公式计算所需的工作液总体积。
    工作液总体积=(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的工作液体积
    
  • 根据所需的工作液总体积，取溶液A：溶液B=1：100，混匀制成工作液。
    
  • 取一试管，加入1μL的30%过氧化氢溶液和8.8mL的纯净水，混匀配成1mM过氧化氢溶液。
    
  • 取8支1.5mL离心管，按照下表平行操作，制备一系列的标准过氧化氢溶液。
    

    成分/管号	0	1	2	3	4	5	6	7
    蒸馏水(μl)	1000	999	990	950	900	850	800	750
    1mM H2O2标准溶液(μl)	0	1	10	50	100	150	200	250
    H2O2标准溶液浓度(μM)	0	1	10	50	100	150	200	250

• 离心管法(分光光度计法)
  
  • 制作标准曲线
    
    • 取16支1.5mL离心管，编号为0~7，每组设置一个重复，分别加入100μL相应浓度的标准过氧化氢溶液。
      
    • 各管加入1mL工作液，迅速混匀。
      
    • 室温静置2～20min(建议设置静置时间梯度，使用新鲜的过氧化氢溶液，此步及过氧化氢溶液品质与标曲是否成线性关系有直接关联，建议设置梯度为2min，5min，10min)。
      
    • 在分光光度计上测各管的A560值。
      
    • 计算编号相同的两个离心管中A560的平均值。
      
    • 以各管A560平均值为纵坐标，对应的过氧化氢浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
  • 未知样品过氧化氢浓度测定
    
    • 将样品做适当的稀释。
      
    • 取3支1.5mL离心管，其中一管加入100μL纯净水作为空白对照，其余两管分别加入100μL样品稀释液。
      
    • 各管加入1mL工作液，迅速混匀。
      
    • 室温静置20min。
      
    • 在分光光度计上测各管的A560值。
      
    • 计算两个相同浓度样品稀释液A560值的平均值。
      
    • 根据两个相同浓度样品稀释液A560值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的过氧化氢浓度。
      
    • 根据下式计算样品的过氧化氢浓度
      样品过氧化氢浓度(μM)=该样品稀释液的过氧化氢浓度×样品稀释倍数
• 酶标板法
  
  • 制作标准曲线
    
    • 在酶标板上取16个孔，编号为0~7，每组设置一个重复，分别加入20μL相应浓度的标准过氧化氢溶液。
      
    • 各孔加入200μL工作液，将酶标板置于摇床上，振荡混匀30sec。
      
    • 将酶标板于室温静置2～20min(建议设置静置时间梯度，使用新鲜的过氧化氢溶液，此步及过氧化氢溶液品质与标曲是否成线性关系有直接关联，建议设置梯度为2min，5min，10min)。
      
    • 在酶标仪上测各孔的A595值。
      
    • 计算相同编号的两孔A595值的平均值。
      
    • 以各孔A595平均值为纵坐标，对应的过氧化氢浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
  • 未知样品过氧化氢浓度测定
    
    • 将样品做适当的稀释。
      
    • 在酶标板上取3个孔，其中一孔加入20μL纯净水作为空白对照，其余两孔分别加入20μL样品稀释液。
      
    • 各孔加入200μL工作液，将酶标板置于摇床上，振荡混匀30sec。
      
    • 将酶标板置于室温静置20min。
      
    • 在酶标仪上测各孔的A595值。
      
    • 计算两个相同浓度样品稀释液的A595值的平均值。
      
    • 根据两个相同浓度样品稀释液A595值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的过氧化氢浓度。
      
    • 根据下式计算样品的过氧化氢浓度
      
    • 样品过氧化氢浓度(μM)=该样品稀释液的过氧化氢浓度×样品稀释倍数。
• 血清或血浆中的过氧化氢含量测量方法
  由于血清或血浆中含有较低的过氧化氢，并且含有内源性的铁离子，产生的背景较高，所以采用过氧化氢的还原试剂TCEP(Tris[2-carboxyethyl]phosphine hydrochloride)测量背景吸收值，再根据标准曲线，从总的待测样品的吸收值减去内源性的铁离子背景吸收值，从而得出血清或血浆中过氧化氢的真实含量。
  
  • 对于每个血清或血浆样品，取4支1.5mL离心管，各管分别加入90μL的血清或血浆样品。
    
  • 其中两管加入10μL的甲醇，另外两管加入10μL含终浓度10mM TCEP的甲醇。
    
  • 涡旋振荡几秒，在室温静置20～30min。
    
  • 各管加入0.9mL工作液，迅速混匀。
    
  • 涡旋振荡几秒，在室温静置20～30min。
    
  • 12000g离心5～10min，转移一定量的上清(离心管法900μL或酶标板法300μL)，测量吸收值。
    
  • 计算加入10μL的甲醇的两管和加入10μL含终浓度10mM TCEP的甲醇的两管的吸收值的平均值。
    
  • 根据标准曲线和吸收值的平均值，计算出含有10μL的甲醇管的过氧化氢含量和含有10μL的含终浓度10mM TCEP的甲醇管的过氧化氢含量。
    
  • 将含有10μL的甲醇管的过氧化氢含量减去含有10μL的终浓度10mM TCEP的甲醇管的过氧化氢含量，从而得出血清或血浆中过氧化氢的真实含量。